NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2 货 号 #E7360L-NEB酶试剂 New England Biolabs

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产品资料 – 用于二代测序的 NEBNext® 试剂 – 适用于所有测序平台:DNA 修复

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2                              收藏

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#E7360L
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#E7360S
24 次反应
2,039.00

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产品特点

该新产品进一步提升了二代测序(NGS)流程中 FFPE DNA 的修复效果

概述

 FFPE 是福尔马林固定石蜡包埋样本,由于其固定和保存的方法,给其中的 DNA 造成严重损伤,因此从 FFPE 样本中获取高质量的序列数据就变得具有挑战性。NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 是一种优化的酶混合物,旨在修复 FFPE 样本 DNA,同时配有经过优化的试剂,能实现更精简的 NGS 文库制备流程。

NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 包含经过优化的酶和缓冲液,可在二代测序流程中以更精简的方式修复 FFPE DNA。
 
NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 在第一代 NEBNext® FFPE DNA 修复混合液的基础上提升了性能:
对于 FFPE DNA 具有更高的修复效率。
更精简的 NGS 文库制备流程。
更方便的反应缓冲液,包含高效修复 FFPE DNA 和随后的末端修复/加 dA 尾所需的所有缓冲液。
使用热敏蛋白酶 K 进行纯化后无需纯化,可直接进入建库步骤。
 
FFPE DNA 的损伤类型及 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 的修复能力。
 NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L
 
NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 与 NEBNext® UltraII DNA 文库制备试剂盒实验流程
NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L
 

产品描述

 

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L

NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复不同质量的 FFPE DNA 后,都能进行高效的文库制备。选用 25 ng 不同质量和组织来源的 Covaris® 超声打断后的 FFPE DNA 样本制备文库。使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复后使用 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)建库,共进行 9 个 PCR 循环。使用 Agilent® HS D1000 TapeStation® 进行文库定量。NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 根据起始 DNA 的质量和损伤类型,不同程度地提高 FFPE 文库的产量。误差条表示每个文库样本两次重复的标准差。

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L

使用 NEBNext® 发夹结构接头和 Unique 双端 Index 引物,UMI 接头,NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复 5 – 250 ng FFPE DNA 后,都能进行高效的文库制备。选用 5 ng、50 ng 和 250 ng 三种不同质量的正常肝脏 FFPE DNA 样本制备文库,比较使用和不使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复的文库制备效果。使用 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)和(a)NEBNext® 发夹结构接头,针对 5 ng、50 ng 和 250 ng 三种起始 DNA 分别使用 11、8 和 6 个 PCR 循环制备文库,以及(b)NEBNext® Unique 双端 Index 引物,UMI 接头(NEB #E7395),针对 5 ng、50 ng 和 250 ng 三种起始 DNA 分别使用 11、8 和 6 个 PCR 循环制备文库。使用 Agilent® HS D1000 TapeStation® 进行文库定量,图中绘制了 2 个文库(5 和 50 ng)和 1 个重复(250 ng)的平均产量。误差条表示 5 和 50 ng 文库重复的标准差。使用 NEBNext® 发夹结构接头和 Unique 双端 Index 引物,UMI 接头,针对 5 ng 至 250 ng 的 FFPE DNA 样本,NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 都能进行高效的文库制备。

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L

NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 能提高各项文库质量指标,包括比对率、正确匹配的双端 reads 和嵌合序列。选用三份 50 ng 不同质量的正常肝脏 FFPE DNA 样本(使用或未使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复),采用 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)制备文库。使用 Illumina NextSeq® 500 测序。向下抽样 100 万个双端 Reads,并使用 Bowtie2(v2.3.2)将 Reads 与 GRCh38 人类参考基因组(RefSeq 884148)进行比对。使用 MarkDuplicates(v1.56.0)分析比对上的 Reads,使用 Picard SAM/BAM 比对汇总指标(v1.56.0)。使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 可提高比对率,并降低非正确匹配和嵌合序列。

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L

 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 能修复 FFPE DNA 样本中存在的大量胞嘧啶脱氨损伤。选用两种 50 ng 不同质量的正常肝脏 FFPE DNA 样本(DIN 2.0 和 DIN 1.8,),使用或未使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复后,采用 NEBNext® UltraII DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)制备文库后,使用 Illumina NextSeq® 500 测序。向下抽样 100 万个双端 Reads,并使用 Bowtie2(v2.3.2)将 Reads 与 GRCh38 人类参考基因组(RefSeq 884148)进行比对。根据等式MAX([C T]-[G A])/([NC]+[NG]),EXP(-10)),使用 MarkDuplicates(v1.56.0)分析比对上的 Reads,使用 Tasmanian(V0.1.3)分析 dCdT(CT)突变。(a):在 Read 1 和 Read 2 中,绘制了 CT 突变频率与 Read 位置(0 – 75 bp)的函数关系图。当使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复后,在两个不同的 FFPE DNA 样本中,这些 CT 突变的丰度和位置偏差都显著降低。(b):Read 2 中的错误突变被量化为总频率。图中结果是每种情况下的两个重复数据。

NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L
NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 能修复 FFPE 和非 FFPE DNA 样本中的氧化损伤。
A:选用两种 25 ng 不同质量不同组织的正常 FFPE DNA 样本,比较使用或未使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 修复的文库结果。使用 NEBNext® UltraII DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)制备文库,并使用 Illumina NextSeq® 500 测序,向下抽样 200 万 Reads,并使用 Bowtie2(v2.3.2)将 Reads 与 GRCh38 人类参考基因组进行比对。使用 MarkDuplicates(v1.56.0)和 Tasmanian(V0.1.3)分析比对上的 Reads。Read 1 中绘制了每个文库 2 个重复数据中 dCdT(CT)突变频率。根据等式 MAX([G T]-[C A])/([NG]+[NC]),EXP(-10))计算 dCdT(CT)突变。
B:以在水*或 Tris-EDTA pH 8.0 中超声打断的 100 ng 人类基因组 DNA 为起始样本,使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 和 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)制备文库。使用 Illumina NextSeq® 500 测序,向下抽样 200 万 Reads,并如上所述分析 GT 突变频率。*注:Covaris 厂家不建议在水中超声打断 DNA,此处用作人为氧化损伤的底物。
 
NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L
与 UDG 处理相比,NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 提高了文库产量。选用四种 50 ng 不同质量不同组织的正常 FFPE DNA 样本(FFPE #1-3,DIN 2.0 和 FFPE #4,DIN 6.7),在使用 NEBNext® UltraII DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645)制备文库前,使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2、UDG(NEB #M0280)处理或未处理。虽然 UDG 可以切除起始 DNA 中的 dU 碱基,但 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 则可以完全修复这些损伤位点,并提高最终文库产量(图 2、3、7)和各项指标(图 4)。
NEBNext®FFPE DNA 修复模块 v2            货   号                  #E7360L

 

使用 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 减少了由胞嘧啶脱氨而引起的体细胞突变中的假阳性。以四种 100 ng 不同质量不同组织的的 FFPE DNA 为起始样本,使用 NEBNext® FFPE DNA 修复混合液(NEB #M6630)或 NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2,NEBNext® Unique 双端 Index 引物,UMI 接头(NEB #E7395)和 NEBNext® Ultra II DNA 文库制备试剂盒(NEB #E7645),10 个 PCR 循环制备文库。使用 custom cancer hotspot panel(Twist Bioscience®)捕获文库,使用 Illumina NextSeq® 2000 测序。所有 fastq 文件向下抽样相同 Reads(新鲜冻存的 Reads 为 2 x 1800万,FFPE 的 Reads 为 2 x 1300 万)。使用 fastp(0.20.0 版本)修剪双端 Reads,并使用 BWA mem(0.7.17 版本)进行比对。picard(2.20.6)中 Markduplicate 使用 UMI 信息。在 fgbio(0.8.1)中处理 UMI 信息以获得共有序列 Reads。体细胞突变从 strelka2(2.9.10)程序 bam 文件调出,数据已用 UMI 矫正了重复序列。根据每种情况的绘制体细胞突变图。NEBNext® FFPE DNA 修复模块 v2 可提高胞嘧啶脱氨修复(CT/GA)效率,并有效修复氧化损伤(GT/CA)。