APSC品牌代理商

APSC品牌代理商–上海金畔

1. APSC品牌介绍
APSC主要提供有机凝胶色谱标准品(Organic GPC/SEC Standards)和水性凝胶色谱标准品(Aqueous GPC/SEC Standards)两类产品。
GPC(Gel Permeation Chromatography),凝胶渗透色谱,又称为尺寸排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,简称SEC),它是基于体积排阻的分离机理,通过具有分子筛性质的固定相,用来分离相对分子质量较小的物质,并且还可以分析分子体积不同、具有相同化学性质的高分子化合物。
GPC是一种特殊的液相色谱,所用仪器与高效液相色谱仪类似,GPC的分离是利用体积排除机理,装填的是多孔性凝胶或微粒,孔径大小与待分离的聚合物分子相似,体积大的高分子化合物不能进入凝胶孔,最先从凝胶粒间流出,淋出体积(时间)最小,高聚物依分子量从大到小依次淋出。这样,通过做已知分子量的高分子聚合物的标准曲线,就能分析同系未知待测高分子化合物了。
2. APSC重点产品
机凝胶色谱标准品(Organic GPC/SEC Standards)和水性凝胶色谱标准品(Aqueous GPC/SEC Standards)两类产品。
3. APSC官网
http://www.ampolymer.com/

4. 金畔生物代理APSC品牌联系方式

上海金畔生物科技有限公司
地 址: 上海市浦东新区东靖路699弄36栋701室
邮 编: 201208
qq:  2743691513
固话总机:021-50837765
订货热线:15221999938
网 址: www.jinpanbio.com
Email:sales@jinpanbio.com

 

Fortis品牌代理商

Fortis品牌代理商–上海金畔

Fortis品牌介绍

Fortis公司于2005年成立,以柴郡为基地,来自有丰富的色谱开发及创新历史的爱尔兰西北部。Fortis旨在为HPLC市场提供创新的产品。Fortis致力于研发及生产最新的HPLC和UPLC色谱柱,
满足和超过客户需求的产品,为客户提供高标准的服务和支持。其提供的填料范围广,从UPLC1.7um到10um。产品包括:UPLC,RP、NP、HILIC 色谱柱。Fortis提供的色谱柱优化色谱分离的峰
形、柱效、稳定性和再现性。

1. Fortis重点产品

产品包括:UPLC,RP、NP、HILIC 色谱柱。Fortis提供的色谱柱优化色谱分离的峰形、柱效、稳定性和再现性。

3. Fortis官网

http://www.fortis-technologies.com

4. 金畔生物代理Thermo Fisher Scientific品牌联系方式

上海金畔生物科技有限公司

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固话总机:021-50837765

订货热线:15221999938

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Bioporto品牌代理商

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1. Bioporto品牌介绍
肾功能损伤早期诊断试剂盒和抗原、抗体(抗体品牌为Antibodyshop),包括早期肾衰竭ELISA试剂盒NGAL(FDA认可)、MBL 、Gc-globulin、ELISA Kit。
2. Bioporto重点产品
肾功能损伤早期诊断试剂盒和抗原、抗体
3. Bioporto官网
http://www.bioporto.com
4. 金畔生物代理Bioporto品牌联系方式
上海金畔生物科技有限公司
地 址: 上海市浦东新区东靖路699弄36栋701室
邮 编: 201208 固话总机:
订货热线:15221999938
24小时短信服务:15221999938
服务投诉:15221999938
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上海金畔生物代理品牌产品及货期

上海金畔生物代理品牌产品及货期

现在,生命科学依旧是我们的业务核心,我们还涉足其它领域,产品分为生命科学,健康保健,新材料和仪器设备四大板块。我们提供一系列创新产品,包括生化试剂、临床诊断试剂、免疫试剂、生物制品、生物制药原料、精细和化妆品行业专用化学品、保健品原料、天然提取物、聚合物、新材料、医用及实验室耗材、仪器设备等。

上海金畔生物科技不仅是美国APSC聚合物标准品在中国的独家代理,还同时是Wako生化试剂、Reagecon物理和化学标准液、BioPorto、Fortis色谱耗材、LaysanBio 修饰性PEG、Bivendor Elisa试剂盒及原料、Lumiprobe 化学发光产品、Ludger糖生物学等品牌授权经销商。种类齐全,到货迅速。上海金畔生物科技有限公司——生物制药、生物诊断原料和科研试剂综合供应商。

主要代理和经销品牌

1、授权代理

公司品牌

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相关产品

货期

WAKO

日本WAKO提供各种生物化学、分析化学、有机化学/合成、环境分析、食品·医药品分析、高纯度及认证标准品等约50万种试剂。

3-4周

BioPorto

丹麦Bioport提供肾功能损伤早期诊断试剂盒和抗原、抗体,包括早期肾衰竭ELISA试剂盒NGAL(FDA认可)、MBL、Gc-globulin、ELISA Kit。

3-4周

APSC

美国APSC主要提供有机凝胶色谱标准品和水性凝胶色谱标准品两类产品,用于校正仪器,测定聚合物样品的分子量。

3-4周

Reagecon

Reagecon公司获得INAB(ISO17025)认证。产品包括pH标准液、电导率标准液、pH电子清洗液、ICP、离子标准液、等物理和化学标准液,应用于分析化学、生物化学、生命科学、环境和高校研究机构。

3-4周

Ludger

英国Ludger公司是一家专注于测量与控制生物医药糖基化的公司提供:Glycan Release Kits 聚糖释放kit;Glycan Labeling Kits 聚糖标记kit;Glycan Purification Kits 聚糖纯化Kit ;Glycan HPLC columns 聚糖HPLC柱、N连接聚糖标准品、2-AA标记聚糖标准品、2-AB标记聚糖标准品。

3-4周

Fortis

Fortis旨在为HPLC市场提供创新的产品,提供的填料范围广,从UPLC1.7um到10um。产品包括:UPLC,RP、NP、HILIC等色谱柱。

2-3周

Lumiprobe

Lumiprobe Corporation是美国一家高品质生物技术公司,专业提供分子生物学研究用的活性荧光染料。产品主要有:活性染料(Reactive Dye)和SYBR Green I 染料,用于寡核苷酸合成的亚磷酰胺,点击化学和其它试剂。

2-3周

Biovendor

BioVendor Laboratory Medicine, Inc. 是欧洲的一家医药科技公司,专注于为分子和细胞学实验室提供体外研究产品,主要产品有重组蛋白、抗体和ELISA试剂盒。目前公司致力于有关激素和细胞活素利用方面的研究,产品相关方向:能量代谢和体重调节;骨代谢;心血管疾病和肾病;感染和发炎;铁代谢研究;肌肉生长控制;神经组织损坏标记;肿瘤学;胰腺调节分子;分泌型磷脂酶A2等。

3-4周

2、生化试剂

Hampton

美国Hampton公司是蛋白质晶体研究方面的专家,为广大研究人员提供了极大的方便,促进了蛋白质晶体的研究,为世界范围内的蛋白质晶体研究人员所信赖。

4周

Megazyme

爱尔兰Megazyme公司提供超过70种诊断试剂盒和超过300种其他试剂和底物用于检测谷物,食品,饲料,发酵,乳制品和葡萄酒行业。其中欧洲检测果汁及葡萄酒等发酵产品基本都采用该公司产品。

2-3周

AATBioquest

AAT Bioquest提供反应荧光探针和发光探针、生物素和端粒酶能、荧光和发光探针、新型荧光和发光探针、提供生理和神经探针,特别是钙离子指示剂和膜电位探针。

3-4周

Epigentek

Epigentek提供DNA修饰试剂盒、染色质免疫沉淀反应试剂盒、非放射性DNA/组蛋白转甲基酶激活抑制试剂盒、DNA-蛋白交联试剂盒、位点特异的组蛋白甲基化试剂盒、表形相关的抗体等。

3-4周

Worthington

美国Worthington是世界上最重要的酶类供应商,酶类产品主要是胶原酶类,胰蛋白酶,木瓜蛋白酶,弹性蛋白酶,和脱氧核糖核酸酶。

3-4周

Cayman

Cayman公司可以提供2,138 多种生化和免疫试剂,涉及肿瘤、氧化氮、神经学、凋亡、氧化性损伤、内分泌学等研究领域。

3-4周

Millipore

Millipore有3个业务部门组成:实验室解决方案部,生物科学部和过程方案部。

4-6周

Anaspec

AnaSpec公司提供专业知识肽,检测试剂,抗体检测试剂盒,寡核苷酸和qPCRs。AnaSpec还提供一流的定制服务,包括多肽合成,抗体生产,研发分析,寡核苷酸合成。

3-4周

MP BIO

美国MP Biomedicals公司提供:DNA/RNA分离和纯化试剂盒、核酸抽提仪器、腺病毒载体、FISH探针、PCR相关试剂、即用型培养基、基因表达和分析研究试剂盒、转染试剂、限制性内切酶、电泳和杂交试剂等。

3-4周

Active Motif

美国Active Motif公司是世界上最大的转录因子研究试剂生产商。为全球从事基因功能研究、基因表达调控及其编码蛋白研究的科研人员,提供高质量的产品和优质的服务。

3-4周

Innova Biosciences

Innova Biosciences 公司专注于生物偶联技术(bioconjugation)–即将两种分子结合在一起形成一个杂合结合物(hybrid conjugate)。Innova提供“一步法”抗体标记试剂盒-Lightning-Link™系列产品极大程度的简化了结合标记流程。

3-4周

Sartorius
赛多利斯

赛多利斯生物技术部门专注于过滤、液体管理、发酵和细胞培养、纯化以及实验室应用。

6-8周

LKT Labs

美国LKT Labs主要提供:癌症药物、药物发现试剂盒、天然产物、广泛的生命科学研究试剂、定制合成。在LKT Labs 可以找到在其他地方找不到的产品。

2-3周

Mirusbio

Mirus以“非病毒(如基于质粒DNA)基因转移方法比利用病毒来转移基因具有明显的优势”为理念而建立。是核酸研究试剂开发的领跑者,其许多杰出成就受到世界公认。

4周左右

Cygnus

Cygnus生物公司是一家专为疫苗生产企业、基因工程药企、研发部门及QA部门提供污染物检测产品的世界著名的美国公司。

3-4周

AppliChem

德国APPLICHEM公司的试剂在欧洲有“小SIGMA”的美誉,产品质量和SIGMA相媲美,价格比其它进口产品更低。覆盖了免疫学、细胞学、分子生物学、蛋白组学、植物学、制药与诊断试剂研发生产等领域。

现货3-5天
期货4周

Biovision

BioVision公司提供用于检测早、中、晚期凋亡的试剂,可以检测凋亡发生的不同区域,包括:线粒体、胞浆、胞膜及胞核。研究趋势有细胞凋亡、细胞增殖、细胞损伤与压力、细胞信号、细胞分馏、胆固醇及肥胖、代谢、分子生物学。

4周

ENZO

ENZO为生命科学研究者提供基因组分析,细胞生物学,翻译后修饰,信号转导,肿瘤和免疫学,药物筛选等相关领域的优质产品。

3-4周

3、天然脂和凝脂

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相关产品

货期

Avanti

美国Avanti主要为各种制药厂和研究机构提供从毫克级到公斤级乃至百公斤级的磷脂类和甾体类中间体和试剂。

4周左右

Larodan

瑞典Larodan是一家专业生产天然酯类生化试剂的公司,主要包括胆酸及甲酯、胆固醇及酯、辅酶A及酰基辅酶A、共轭亚油酸、二元酸及酯、支链/直链脂肪酸甲酯、标记物、神经节苷酯、甘油酯、磷脂等3000多种。

2-3周

4、抗体

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相关产品

货期

GeneTex

美国GeneTex公司提供癌症研究相关抗体。目前抗体总数已逾45,000种,且每月推出近400种新抗体。其中,兔多抗和鼠单抗为其优势产品。

3-4周

Agrisera

瑞典Agrisera公司致力于植物/环境科学研究中所需蛋白抗体研发与销售,主要集中于模式之物及其他植物的生理、病理相关的蛋白抗体。Agrisera的所有抗体分两大类:植物及藻类的抗体,以及细菌、真菌、昆虫、鱼等动物类抗体,植物领域的抗体。

3-4周

ProSpec

ProSpec可以提供细胞因子,生长因子,激素,信号蛋白,病毒抗原等近800种重组蛋白和100多种抗体。绝大部分产品是天然成熟型蛋白,而不含有标签蛋白。

3-4周

AbD Serotec

英国Serotec公司可以提供上万种抗体和免疫学试剂、单抗制备和多种规模的抗体生产和标记服务。主要产品系:Human CD、Rodent、Veterinary、Cell biology and Apoptosis、Flow Cytometry、Immunohistology、Secondary Reagents;其中大鼠抗体和各种动物研究试剂,Serotec在全世界处于领先地位。

3-4周

eBioscience

美国ebioscience专注在人和小鼠的CD系列/细胞因子相关试剂流式抗体.大部分产品的克隆号与PMG一样,产品种类丰富:包括人、小鼠和大鼠的免疫学相关试剂。

3-4周

KPL

KPL是美国最早实现亲和素纯化二抗商业化的生物公司,同时也是世界上最大的二抗和底物显色系统生产商。产品有:亲和纯化的二抗、ELISA底物及试剂盒,蛋白检测和纯化试剂盒,核酸标记和检测等试剂,金标记、生物素标记、细菌抗体等。

大部分有现货
周二下单
期货3-4周

CST

美国CST是提供特色的信号转导检测用抗体及磷酸化抗体,ELISA试剂盒,激酶等产品。

3-4周

5、校准及分析标准品

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相关产品

货期

USP

美国药典是美国政府对药品质量标准和检定方法作出的技术规定,也是药品生产、使用、管理、检验的法律依据。NF收载了美国药典(USP)尚未收入的新药和新制剂。

3-4周

EP

《欧洲药典》为欧洲药品质量检测的唯一指导文献。所有药品和药用底物的生产厂家在欧洲范围内推销和使用的过程中,必须遵循《欧洲药典》的质量标准。

3-4周

BP

英国药典是英国药品委员会正式出版的英国官方医学标准集,是英国制药标准的重要出处,也是药品质量控制、药品生产许可证管理的重要依据。

3-4周

NIST

美国国家标准局(NIST)制定的“标准参照样品(SRM)”,共有1100多种,每种标样都有美国国家标准局的详细分析报告和用途说明。

3-4周

LGC

LGC是Laboratory of the Government Chemist的简称,中文名英国政府化学家实验室,是化学和生物计量、法医、诊断科学服务及标准物质方面的市场领导者。

3-4周

TRC

加拿大TRC公司是一家专业生产药品、药品代谢物、物质同位素标记物、药物杂质等分析标准品的公司

3-4周

TLC

加拿大TLC标准品, TLC是独立的服务公司,专业定制合成复杂的有机化学物质对生物医学和制药研究

3-4周

DR

德国Dr.Ehrenstorfer公司是欧洲提供环境标准品的主要公司之一。具有超过40年的生产历史,现在可以提供超过5,000种的化学标准品

3-4周

Chiron

挪威Chiron标准品,CHIRON 公司是挪威的一家20年历史的稳定性同位素供应商。

3-4周

ChromaDex

ChromaDex公司的产品主要包括:化合物对照品、植物化学对照品、试剂盒 ;美国草药药典标准品。

3-4周

ChemService

通过美国实验室证学会认证,生产化学标准品的专业厂商。

3-4周

6、糖生物学

公司品牌

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相关产品

货期

TdB

TdB公司提供葡聚糖、硫酸葡聚糖、葡聚糖衍生物:DEAE-葡聚糖、CM-葡聚糖、Q-葡聚糖、苯基葡聚糖等、FITC标记葡聚糖、FITC标记菊糖、TRITC-标记葡聚糖、蓝色葡聚糖等

2-3周

Iduron

英国Iduron是专业从事糖胺生产和销售的公司,为从事科研及产品开发提供独特和优质的GAGs产品.

3-4周

Elicityl

法国的Elicity公司提供200多种多糖和寡糖。其中的60多种低聚糖有众多不同领域的应用潜力,如防癌疫苗,抗感染,抗神经退化,诊断或功能性食品等。

3-4周

DEXTRA

英国Dextra公司提供研究用糖库,主要用来探索功能糖和筛选酶抑制剂。

3-4周

7、微生物和细胞组织培养

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相关产品

货期

Nissui

Nissui提供全面的食品工业,诊断工业生产和研究用培养基,包括细胞培养基、微生物培养基、致密固体培养基Compact Dry等。

4周

Phytotech

美国PhytoTechnology是一家专门从事于研发和生产植物组织培养基,已经成为了世界上著名的植物生物学类产品的生厂商和原料供应商。

4周左右

Gibco

Gibco提供DMEM,MEM,RPMI1640等液体及粉末细胞培养基,无血清培养基和专用培养基,各种种属的优质动物血清,氨基酸,抗生素,生长因子等细胞培养添加剂,昆虫细胞以及293等哺乳动物细胞。

现货1周
期货1个月

Hyclone

HyClone公司提供高品质胎牛血清(FBS)及其他血清产品、各类经典的细胞培养基、无血清和无蛋白培养基,

3M

3M 公司提供微生物检测产品主要应用于食品、饮料及相关行业的微生物检测,在全球食品检测领域均有广泛的使用。

期货4周

OXOID

Oxoid公司提供培养基、微生物培养、诊断试剂、生化鉴定、药敏纸锭。产品范围阔及与疾病、微生物诊断相关的临床检验科学、基础学术研究与工业生产领域。

期货:6-8周
LP21,LP42常备

8、聚合物类

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相关产品

货期

LaysanBio

美国Laysan Bio提供PEG试剂用于7个FDA或欧盟批准的药品或医疗器械,包括Neulasta®, Somavert®, PEGASYS®, PEG-INTRON®, Definity®, Macugen® and DuraSeal™。

3-4周

Polymer source

加拿大Polymer Soruce主要提供:A.稳定的氘代聚合物;B.特种聚合物;C.特种单体和齐聚物;D.高纯化学试剂等。

3-4周

Polymer factory

瑞典Polymerfactory致力于聚合物研究,产品线包括:Dendrimers 树枝状聚合物、树突聚合物、超支化聚合物、树枝状多功能PEGS、质谱标准品等。

3-4周

Scientific Polymer

美国Scientific Polymer提供广泛的产品:单体&增塑剂、增塑剂套装、色谱柱、除对苯二酚和甲醚对苯二酚柱、除t-丁基邻苯二酚柱、聚合物标准品、离子交换树脂、聚合物套装和根据客户需要定制产品。

3-4周

Rapp Polymers

德国Rapp Polymers提供创新性的先进的树脂,使TentaGel树脂商业化。随后研发生产出PEG衍生物。为固相合成(SPS)提供广泛地高质量的树脂及广泛地聚乙二醇衍生物(PEG)。

3-4周

9、耗材类

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相关产品

货期

Agilent

安捷伦科技有限公司是世界最大的测试测量公司,是全球电子测量、生命科学与化学分析的领导者。

货期视库存定

NUNC耗材

NUNC致力于为世界各国的科研人员提供顶级的一次性塑料实验器具。其中,细胞培养系列产品,酶标系列产品,细胞工厂系列产品,以及冷冻保藏系列产品等已经成为生命科学用户的首选。

现货10天
期货3个月

Rainin

RAININ(瑞宁)提供移液器及耗材。

现货3天
期货2周

ISOLAB

德国ISOLAB提供实验室耗材设备,包括玻璃器具、色层分析、微生物学、分析检测用耗材仪器、安全设备等。

4-6周

Labnet

美国Labnet公司主要产品有离心机、移液器、烘箱、培养箱、三维脱色摇床,电泳仪,凝胶成像系统等,产品畅销欧美各国。

大部分现货

Axygen

美国Axygen公司主要产品为实验室耗材,包括:吸头、PCR薄壁管、PCR板、PCR封口膜、离心管、离心管架和分离柱。

常用现货

Corning

Corning公司是凭借在光学、材料科学、特殊表面和生物方面等多专业领域内的丰富积累,康宁的一系列革命性解决方案,提高制药业产能,并使突破性发现成为可能。

可查库存

Brand

德国BRAND生产制造最广泛的的移液操作产品线,诸如分液器Dispensette® 与移液器Transferpette® 以及相关的BRAND耗材满足生命科学实验领域的广泛应用需求。

1-2周

Wheaton

Wheaton产品包括玻璃和塾料容器、细胞培养产品、色谱产品及其它实验室用玻璃仪器。

3个月

Greiner bio-one

德国Greiner是著名的耗材供应商,主要产品包括细胞培养产品、检测微孔板、微生物培养皿、培养管及巴氏吸管等。

3个月

VP

VP提供湿热高压灭菌、Eto(环氧乙烷)灭菌、干热灭菌和辐射灭菌包装袋,测试灭菌器性能的BD测试包,灭菌指示带等。

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Bio-rad品牌代理商

Bio-rad品牌代理商–上海金畔

1. Bio-rad品牌介绍
美国伯乐BIO-RAD公司公司总部设在美国加里福尼亚州的Hercules,在全球有30多家全资子公司,服务于全球超过85,000家科研院所,生物技术和制药公司,和临床实验室。
BIO-RAD公司自1952年成立以来,在50多年中为临床诊断和生命科学研究市场提供了广泛的新型产品和服务,始终居于科学发现的中心地位。 BIO-RAD公司 现今利用多种技术制造并
生产了几千种产品,这些技术包括蛋白质组学、生物信息学、电泳、成像、免疫测定、层析、微生物学和基因转移。根据产品的不同,BIO-RAD公司公司下设三大部门,它们是生命科学部,临
床诊断部和工业材料部,产品种类达6000余种。BIO-RAD公司主要产品有蛋白组研究产品、层析仪与填料、蛋白质和核酸电泳产品、基因枪与电穿孔仪、定量基因扩增仪、图像分析系统、激光
共聚焦扫描显微镜、酶标仪和洗板机系列、食品检测仪器与试剂、糖化血红蛋白检测系列产品、质控系统、毒物检测产品、血液病毒检测产品等。
2. Bio-rad重点产品
生命科学试剂
临床诊断试剂
3. Bio-rad官网
www.bio-rad.com
4. 金畔生物代理Bio-rad品牌联系方式
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多酚氧化酶(PPO)的分离提取 DEAE-纤维素DE 52

实验一 多酚氧化酶(PPO)的分离提取 DEAE-纤维素DE 52

一、原理与目的
多酚氧化酶是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶,植物受到机械损伤和病菌侵染后,PPO催化酚与O2氧化形成醌,是组织形成褐变,以便损伤恢复,防止或减少感染,提高抗病能力。醌类物质对微生物有毒害作用,所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应,因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联,起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐变及营养丧失的主要原因之一。PPO氧化内源的酚类物质生成邻醌,邻醌再相互聚合成醌或蛋白质、氨基酸等作用生成高分子络合物而导致褐色素的生成,色素分子量愈高,颜色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标之一。
本实验将采用马铃薯为主要材料,通过组织细胞破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液。
通过本项实验,学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法,掌握相关仪器设备的操作使用,以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、材料与试剂
(1)马铃薯(大约每小组100-200g)
(2)试剂:
0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml;固体硫酸铵;0.03M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,0.005MgCL2)配置时配
(3)实验器械与仪器设备:
试管与试管架;烧杯、玻璃搅棒;移液管、滴管等;试剂瓶;透析袋;
过滤纱布;植物组织匀浆器;pH计和pH试纸;GL-20C高速冷冻离心机;
DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、操作步骤
1:粗酶提取:
水果肉组织按1:1(W/V)比例与003M磷酸缓冲液PH6.0(内含0.02M巯基乙醇,0.001MEDTA,5%甘油,1%聚乙烯吡咯烷酮)混合,匀浆4层后纱布过滤,滤液以6000rpm离心10min,弃除沉淀获得酶提取液。
2:盐析分级沉淀:
在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),然后6000rpm离心20min弃除沉淀;离心上清液在加入固体硫酸铵达到70%饱和度(边加边搅拌达到充分溶解),再以6000rpm离心20min,弃除上清夜,收集粗酶沉淀。
四、实验结果
获得PPO粗酶液。
实验二 PPO粗酶液的纯化
一、原理
1.葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析 利用大分子不能进入凝胶颗粒内部 最先流出柱外,而小分子物质进入凝胶颗粒内部,流速慢而最后流出柱外,凝胶层析法能将不同分子大小的物质分离开。(G-200能分离800-80000D分子量的蛋白质)
2.利用离子交换法,选取DEAE-阴离子纤维素DE52柱材料,因为PPO是带有阳离子的蛋白质,在层析时会吸附在柱材料上,而杂蛋白会洗下。后用NaCl梯度洗脱PPO,(NaCl为强离子交换剂,能将弱吸附在柱材料上的PPO置换下来)。粗酶液从而得到纯化。
二、材料与试剂
试剂:0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)配制时配×10倍浓缩液1000ml;NaCL;聚已二醇;DEAE-纤维素DE52;葡聚糖凝胶Sephadex G-200;兰葡萄糖-40、70、100等;
实验器械与仪器设备:试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管等;试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机
三、操作步骤
1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡
(1)柱材处理
称取一定量的Sephadex G-200干粉,加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48h,去掉悬浮的细微颗粒,为防止凝胶颗粒中的空气存在,影响层析效果,凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉,其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中,进行抽真空处理,直到凝胶液中没有气泡出现为止。
(2)装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液(凝胶的浓度过高会产生气泡,影响蛋白质分离速度,浓度过低易产生凝胶分层,影响蛋白质的分离效果)轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱,剪一与柱内径相等的滤纸片覆盖于凝胶上。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出液口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。
(3)平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA),平衡Sephadex G-200凝胶。
2.上样:将粗酶液上柱。
3.洗脱:用0.02M Tris-HCL缓冲液Ph7.4(内含0.001M EDTA)洗脱,收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
4.DEAE-纤维素的处理及装柱
(1)处理
本实验采用的是DEAE-纤维素DE 52 是弱酸型阴离子交换剂,具体处理方法为:先将DE52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中,去除杂质;再在0.5N的HCL溶液中浸泡1-2h,再用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或PH4以上,并将其在抽滤漏斗中抽干;将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的NaOH溶液中1-2h,再用无离子水或蒸馏水将其洗至中性。
(2)装柱
将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上,加1/3体积的无离子水,打开下出液口,水流畅通,即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材,轻轻倒入层析柱中,凝胶自然慢慢沉降再层析柱底部,凝胶沉积直到离层析柱上端1.5-2cm处,停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵,下出口连接蛋白质监测仪,待层析柱的平衡。
(3)平衡
在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡,所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程的缓冲液(洗脱液)置换出来,使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是:利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内,打开层析柱下端的出口,平衡液流速在0.5-1ml/min,当下出口流出液的PH值与平衡缓冲液的PH值一致时,层析柱达到了平衡。在本实验中,用0.002M Tris-HCL缓冲液PH7.4(内含0.0001M EDTA),预先将DE-52柱进行平衡。
5.上样:
将洗脱酶液上样,用0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)洗脱杂蛋白。
6.洗脱:
用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02M Tris-HCL缓冲液pH7.4(内含0.001M EDTA)进行梯度洗脱。
7.测定酶活性和蛋白质浓度
实验三 PPO活性测定
一、原理与方法
PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物,在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中,PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌,在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化,通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是:在含有4mlPH5.8的0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液,反应5分钟,在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下,以A410读数,以每分钟增加0.01O.D.值定义为一个酶活性单位(U)。
二、仪器与试剂
(1)样品:
多酚氧化酶粗酶液
硫酸铵沉淀组分
DE-52洗脱组分
葡聚糖凝胶洗脱组分
(2)底物:
邻苯二酚:O.01M邻苯二酚溶液
(3)反应体系:
0.2M邻酸二氢钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8
(4)器皿与仪器:
试管、恒温水浴等
分光光度计
三、酶蛋白的比活性
比活性=酶活单位(U)/mg蛋白质
四、实验结果与分析
1. Sephadex G-200的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)
结果列表
试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.16 0.09
粗酶液 0.20 0.14 4 0.03 0.03
1 0.00 0.01 5 0.03 0.01
2 0.13 0.09 6 0.02 0.02
分析:2和3试管中含绝大部分所需蛋白,保存进行下一步纯化。
2. DE-52的洗脱组分的相对浓度(OD590)和相对酶活(OD410)
结果列表
试管号 蛋白质浓度 PPO酶活 试管号 蛋白质浓度 PPO酶活
空白 0 0 3 0.03 0.05
粗酶液 0.22 0.16 4 0.09 0.05
1 0.00 0.00 5 0.07 0.02
2 0.03 0.02 6 0.03 0.00
分析:酶活性高低不一定与蛋白含量高低成正比,3和4试管中含较多所需蛋白。
实验四 胰酶分离提取
一、原理与目的
提取制备酶的经典方法,多采用硫酸铵分级沉淀,胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀,其它杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取,最后在PH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。
胰酶在PH3.0时最稳定,可在低温下储存较长的时间而不失活;低与此PH酶易变性;高于PH5时,酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程应在低温和低PH下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我环化成为有活性的酶。猪胰蛋白酶原分子量约24000-25000,而猪胰酶分子量为23400。在酶原活化的过程中,酶原N端Lys与Ile之间的 一个肽链被断裂,丢失一个6肽,分子构象发生改变,PI变成10.8。
本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验,掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。
二、材料与试剂
1.仪器
紫外光分光光度计、恒温水浴、离心机、组织捣碎机、PH计、显微镜、秒表、剪刀、镊子、搪瓷盆、乳钵、大玻璃漏斗、抽滤瓶,塑料小桶、纱布、PH试纸,滤纸、玻璃器皿等。
2.材料:新鲜猪胰脏
3.试剂及溶液配制
pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸缓冲液(母液为0.8M,用时稀释一倍)、Tris、硫酸铵。
0.8M pH9.0硼酸缓冲液:取20ml0.8M四硼酸钠溶液,混合后用PH计校正。
三、操作步骤
1.胰蛋白酶原的提取与分离:
(1)称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏,在冰浴下剥除脂肪和结缔组织,在低温下用绞肉机绞碎胰脏(或用高速组织匀浆机捣碎)加1-2倍体积以预冷却的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g组织相当于1ml体积计算,以此类推)。检查提取液中PH,若高于PH3.0时应及时用10%乙酸调节,使提取液维持PH2.5-3.0之间。在冷室5℃左右搅拌提取18-24h,而后用4层纱布过滤,尽量拧挤出滤液,滤液呈乳白色,用约300mlpH2.5乙酸酸化水再提取残渣一次(时间约为1-2h),合并滤液,此时滤液PH值较高,可用5M H2PO4溶液调整PH至2.5-3.0,放置 3-5h后,浑浊滤液冷却后,用玻璃漏斗进行自然过滤,滤液呈黄色透明液体,收集滤液,量其总体积,弃去沉淀物。
(2)盐析:滤液加固体粉状硫酸铵进行盐析,使溶液至75%饱和度。盐析溶液放冷室中过夜,次日用4000r/min离心机离心,或用布氏漏斗抽滤,滤饼经压干后称重,可得约20g胰蛋白酶原粗制品。
(3)胰蛋白酶原得激活:将胰蛋白酶原粗制品用10倍体积得冷蒸馏水,分多次加入使滤饼溶解,溶液呈乳白色,量其体积,取出1ml溶液用于测定,溶液中硫酸铵得含量(约为滤饼重得1/4)。因为硫酸铵可以与活化剂钙离子结合,生成硫酸钙,如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程,按浓度量计算,将已研细的固体CaCL2慢慢加入酶原溶液中,边加边搅拌均匀。用5MNaOH溶液调PH至8.0。在酶溶液加入约5mg结晶猪胰蛋白酶,轻轻搅拌均匀,置5℃冰箱中使酶原活化。
(4)纯化:去除杂蛋白,量取胰蛋白酶溶液体积后,用5M硫酸溶液调节滤液PH至2.5-3.0,抽滤除去硫酸钙沉淀,滤液体积约1000ml,加入已经研细的硫酸铵粉末,使其溶液达40%饱和度(每升滤液加242g硫酸铵)。放置5℃冰箱中5-8h,抽滤除去沉淀。
实验五 卵清蛋白分离提取
一、实验目的与原理
鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中,对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的,而在碱性溶液中较不稳定。
由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用,因此可以用鸡卵粘蛋白做亲和配基配制纯化胰酶的亲和材料。
二、材料与试剂:
1.材料:新鲜鸡蛋2只
2:仪器:抽滤瓶500-1000ml、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器
3:试剂:
10%TCA,用固体NaOH调调PH至1.05-1.10,需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M,PH8.0Tris-HCL缓冲液(每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2),50ml
pH8.0,0.1M Tris-HCL缓冲液
三、操作步骤
1,取两只新鲜鸡蛋,得蛋清50ml,置于烧杯中,外用温水浴25℃-30℃,在不断搅拌条件下,缓慢加入等体积得三氯乙酸-丙酮(1:2V/V),立即出现大量白色絮状沉淀,加完后最终PH约3.5,再继续搅拌30min,然后在4℃冰箱中放置过夜。
2,次日用布氏漏斗抽滤,得黄绿色清液。
3,边搅拌边加入4℃预冷的丙酮200ml沉淀蛋白,在4℃放置2h之后将上清液小心倒入瓶中回收,下部沉淀部分于4000rpm离心5min,收集沉淀。
4,将沉淀溶于10ml无离子水中,对无离子水(50倍)透析4h,换水两次,再对碳酸钠缓冲液透析过夜,4000rpm离心10min ,去除不溶物。
实验六 亲和层析纯化胰酶
一、实验目的与原理
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间,抗原与抗体之间,结合的双方不仅是专一的,而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性,如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固体载体上作为固定相,那么另一方随着流动相流经该固定相的时候,双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离,即能得到于固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
本实验通过将胰蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)(protease inhibitor)-鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作,以了解亲和层析的基本原理,掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。
二、仪器与试剂
1.鸡卵粘蛋白制备
2.Sephadex-G75的活化和偶联
2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 (溶于20ml水)
3.亲和层析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶约50ml 、0.1N甲酸钾、0.5M KCL pH2.5 100ml
仪器器材:抽滤瓶500-1000ml、层析柱、紫外分光光度计、紫外蛋白检测仪、烧杯漏斗、移液管、磁力搅拌器
三、操作步骤
1、鸡卵粘蛋白的制备
2、Sephadex-G75的活化及偶联
2.5g干重的葡聚糖凝胶Sephadex-G75溶胀洗涤数次,缓慢搅拌,加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min,蒸馏水洗涤数次,抽干备用,活化凝胶,纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水,加入活化葡聚糖凝胶,75%K2CO3,调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h。反应过程随时加入5%K2CO3,以维持pH的稳定。0.27gKBH4 溶于20ml水,缓慢搅拌加入上述体系反应5h,pH维持在6.5-7.5,洗涤。
3、胰蛋白酶的亲和层析
卵类粘蛋白在pH7-8的条件下能与胰蛋白酶专一地结合,而在pH2-3时又能解离,因而掌握好上柱地PH条件和洗脱缓冲条件,便可将胰蛋白酶从含杂蛋白地粗酶液中选择性地结合于柱上,待洗去不结合或非专一性结合地杂蛋白后,改变PH值便可将胰蛋白酶洗脱下来。从而达到纯化地目的。由于亲和层析结合地专一性,上柱体积可以比较大,得到浓缩的提纯产品。
(1)亲和层析
将鸡卵粘蛋白-Sephadex-G75装柱(1×10cm),用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的缓冲液平衡,平衡约2-3倍的柱体积。将粗胰酶液上柱层析。用紫外蛋白监测仪280nm处检测蛋白质吸收峰,随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡,吸收峰达到稳定,一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时,则胰蛋白酶溢出,使吸收峰升高,此时应停止样品上样,改用pH7.5的平衡缓冲液冲洗出杂蛋白,待洗出液的吸收回到基线后,改用0.1N的甲酸钾0.5M KCL,Ph2.5的洗脱液解析,柱的流速维持在1.5ml/min左右,收集洗脱下来的蛋白峰蛋白,测总蛋白量及比活性,并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数,总蛋白回收率,胰蛋白酶量。
当胰蛋白酶峰洗出,待紫外吸收回到基线后,重新用缓冲液平衡,亲和层析柱可以反复使用。
(2)胰酶蛋白和活性测定

 

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