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BSA，分子生物学级
分子生物学级别的重组白蛋白，是非牛类衍生的白蛋白，可以作为牛血清白蛋白（BSA）的替代品。与BSA一样，可以用于防止酶粘附到反应管壁上及移液枪表面。还可以用于在孵化期间稳定某些蛋白质。当需要避免牛血清白蛋白时，可以选择重组白蛋白。
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NEB PCR 试剂盒提供：优化的 2X 克隆预混液（其中配有独特的连接增强剂）和线性载体。该线性载体利用最新技术抑制背景菌落生长，使背景值降为最低。本试剂盒能简单、快速克隆各种 PCR 产物。具有校读功能的聚合酶产生平末端扩增子（如：Q5 或者 Phusion），无校对功能的聚合酶产生单碱基突出末端的扩增子（如 Taq、OneTaq、LongAmp Taq)。2X 克隆预混液中包含有末端修复成份，可在连接反应步骤前进行末端平齐化，因此，无论扩增子是何种末端都能完成有效连接。此外，使用本试剂盒，PCR 产物无需纯化，PCR 引物也无需经过 5´ -磷酸基修饰。
NEB PCR 克隆试剂盒经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。详情请联系我们。 www.neb.com，www.neb-china.com。
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请注意：该产品已停产，库存售完为止，替代产品为 E1601。
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NEB 5-alpha E. coli 感受态细胞（高效级）
NEB 10-beta E. coli 感受态细胞（高效级）
Q5 热启动超保真 2 X 预混液
使用新酶 BsaI-HFv2（针对 Golden Gate 应用优化）
无缝克隆 – 组装后无额外碱基存在
目的质粒含 T7/SP6 启动子
单次反应即可按顺序组装多个片段（2-20+）
也可用于单个片段克隆和文库制备
有效组装高 GC 区和重复区
兼容片段长度广（＜100 bp 至 ＞15kb
– BsaI (NEB #R0535)
– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)
– BbsI (NEB #R0539)
– BbsI-HF (NEB #R3539)
– BsmBI (NEB #R0580)
– Esp3I (NEB #R0734)
NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsaI-HFv2）内含优化的混合液。利用 Golden Gate 方法，混合液中的 BsaI-HFv2 和 T4 DNA 连接酶可以完成多个片段的组装。试剂盒自带目的质粒 pGGA，为组装提供骨架，同时为亚克隆提供限制性内切酶酶切位点，以及为体外转录提供 T7/SP6 启动子序列。
Golden Gate 可高效、无痕地克隆组装 DNA片段。该方法起始于 1996 年，当时是第一次使用 IIS 型限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶依次或同时将多个目的基因插入到同一个载体骨架上。
IIS 型限制性内切酶结合于识别位点，却在识别位点的下游特定位置进行切割，切割位点是位置特异的，而非序列特异的。这样，单个 IIS 型限制性内切酶可用于产生具有特定突出末端的 DNA 片段。例如，BsaI 的识别位点为 GGTCTC（N1/N5），其中 GGTCTC 是识别和结合位点，而 N1/N5 表示切割位点位于上链的第一个碱基后，下链的第五个碱基后。片段连接是通过酶切产生的 4 个碱基突出端互补而形成。酶切后的片段及最终组装产物不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，所以不可能进一步发生酶切。组装产物随时间逐渐积累。
该方法特别适用于多重组装实验，例如 TALEs （转录激活因子样效应物）和 TALENs（TALES 与 FokI 核酸酶催化结构域融合表达）。Golden Gate 方法也适用于单一目的基因的克隆实验以及不同来源基因的文库构建。
连接酶保真度的研究进展：NEB 的不断研究加深了我们对连接酶保真性的认识，包括评价末端连接保真度的多种手段的开发，从而更好地预测何种突出末端具有更高连接保真度。该研究使突出末端的选择更为慎重，这对于构建复杂 Golden Gate 组装产物尤为重要。更多详情请联系我们。 www.neb.com/goldengate
为加快实验进程，请联系我们。 GoldenGate.neb.com 使用设计软件。
Ligase Fidelity Viewer*
使 Golden Gate 突出末端连接组装设计变得可视化。*这是一个 NEBeta™ 软件，在设计和使用上还不够完善。欢迎分享您的使用反馈。使用该软件请联系我们。 www.neb.com/research/nebeta-tools。
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·试剂盒含 BsmBI-v2，经优化用于 Golden Gate 组装
NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）是 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的优化预混液。BsmBI-v2 是 NEB 公司研发的 BsmBI 的升级版本，在 Golden Gate 组装中的表现优于原酶。这些酶联合使用可完成多个插入片段/模块的组装，也可用于单插入片段克隆/文库构建。试剂盒提供 pGGAselect 目的质粒，作为组装骨架。该多功能目的质粒上定向克隆有 BsmBI-、BsaI- 和 BbsI- 的识别位点，使其能方便地与这三种在 Golden Gate 中最常用的 IIS 型限制性内切酶一起使用。该质粒还含有多个限制性内切酶识别位点，方便进行亚克隆，并具有 T7/SP6 启动子序列，供体外转录使用。
图 2. Golden Gate 工作流程
简单来讲，Golden Gate 组装需要 IIS 内切酶的识别位点，在本示例中，需要在 dsDNA 片段的两端加上其识别位点（CGTCTC）。酶切后，识别位点被切除，组装片段末端带有设计好的特定 4 碱基突出以指导组装。
图3. 用 BsmBI-v2 进行高效和高保真 Golden Gate 组装
遵循 11-20+ 片段组装的推荐循环步骤，在含有 LacI/LacZ 的表达框中组装 24 个片段。虽然 30 个循环足以完成复杂组装，但 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶的稳定性允许连续进行 65 个循环的组装且背景低。（a）组装效率和（b）组装准确性（保真度）与循环数的关系如图所示。
图4. 用 BsmBI-v2 和 T4 DNA 连接酶进行复杂组装
NEB Golden Gate 组装试剂盒（BsmBI-v2）包含：
– NEB® Golden Gate 酶预混液
– T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
– pGGAselectII DNA
用于 Golden Gate 的 IIS 型限制性内切酶
– BsaI (NEB #R0535)
– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)
– BbsI (NEB #R0539)
– BbsI-HF (NEB #R3539)
– BsmBI (NEB #R0580)
– BsmBI-v2 (NEB #R0739)
– Esp3I (NEB #R0734)
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– NEB® Golden Gate 酶预混液
– T4 DNA 连接酶反应缓冲液（10X）
– pGGAselectII DNA
用于 Golden Gate 的 IIS 型限制性内切酶
– BsaI (NEB #R0535)
– BsaI-HFv2 (NEB #R3733)
– BbsI (NEB #R0539)
– BbsI-HF (NEB #R3539)
– BsmBI (NEB #R0580)
– BsmBI-v2 (NEB #R0739)
– Esp3I (NEB #R0734)
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1. Engler, C. et al.(2008).PLoS ONE. 3, e3647.
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Convenient one-step protocol
Digests both DNA and RNA to single nucleosides
Low-glycerol formulation significantly reduces glycerol-induced ion suppression during MS analysis
核苷消化混合液是复合酶，能一步将 DNA 或 RNA 消化成单核苷，省去了多步耗时的消化步骤，特别适用于液相色谱-质谱（LC-MS）定量分析。
1X Nucleoside Digestion Mix Reaction Buffer. Incubate at 37°C.
-20°C
1. Dilution of the Nucleoside Digestion mix may result in a decrease of enzymatic activity and incomplete
digestion of substrate. Therefore, we recommend using 1 µL of the Nucleoside Digestion Mix for
digestion of samples containing < 1 µg of DNA or RNA substrate.
2. Samples containing a large number of modifications (particularly modifications at the ribose 2´-position)
may benefit from overnight incubation with the Nucleoside Digestion Mix in order to achieve complete
digestion. No signal deterioration has been observed by incubating DNA or RNA samples with the
Nucleoside Digestion Mix for up to 24 hours at 37°C. Alternatively, the ratio of Nucleoside Digestion
Mix:nucleic acid may be increased from 1 μl/μg substrate to 5-10 μl/μg substrate to ensure complete
digestion.
3. Although it is not necessary to stop the reaction prior to LC-MS, the mix can be inactivated by the
addition of EDTA (5 mM, final concentration).
4. In order to reduce the ion suppression effects of glycerol, the Nucleoside Digestion Mix has been
formulated to contain very little glycerol (<1%) and therefore the mix will freeze when stored at -20°C.
The mix is stable for >2 years when stored at -20°C and can withstand 50 freeze-thaw cycles without
significant activity loss.
5. As carryover of certain reaction components (e.g., EDTA, detergents, etc) from upstream steps may
result in incomplete digestion, it is highly recommended that DNA or RNA substrates be purified
(column purification/phenol chloroform extraction) before digestion with the Nucleoside Digestion
Mix.
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NEB 提供分子量大小从 17-9,000 bp 的 RNA Marker 和 Ladder。低范围 ssRNA Ladder 适用于变性和非变性凝胶电泳中 RNA 的分子量标准。两种 ssRNA Ladder 均提供 2X 上样缓冲液，亮度加倍的条带可作为参照带。microRNA Marker 已溶于即用型变性上样液中，可用作变性聚丙烯酰胺凝胶和 Northern 杂交中的分子量标准，使用 SYBR-Gold 染料染色效果最佳。随 Marker 提供 3´ -生物素标记的 21-mer 寡核苷酸探针，可以用 γ32-P-ATP 和T4 PNK（NEB #M0201）进行标记。dsRNA Ladder 适用于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳，作为 dsRNA和 RNAi 分析的分子量标准。
低范围 ssRNA Ladder、ssRNA Ladder、dsRNA Ladder 的浓度为 500 μg/ml。MicroRNA Marker 浓度为
12 ng/μl。
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