样品实验方案
简要概述
- 在生长培养基中准备细胞
- 添加Fura-2 AM染料加载溶液(对于96孔板为100 µL /孔,对于384孔板为25 µL /孔)
- 在室温下孵育1-2小时
- 检测Ex / Em = 340/510 nm和380/510 nm的荧光强度
溶液配制
储备溶液配制
1. Fura-2 AM储备溶液:将200 µL DMSO加入小瓶Fura-2 AM(组分A)中,并充分混合。 注意:20 µL Fura-2 AM储备溶液足以装满一块板。 如果试管密封严密,可将未使用的Fura-2 AM储备溶液分装并在<-20℃下保存超过一个月。 避光并避免重复的冻融循环。
2.分析缓冲液(1X):a)对于#36320(10板试剂盒),通过将9mL HHBS(组分C)添加到10XPluronic®F127 Plus(1 mL,组分B)中来制成1X分析缓冲液,并充分混合。
b)对于#36321(100个板试剂盒),通过向10XPluronic®F127 Plus(10 mL,组分B)中加入90 mL HHBS(未包括)制成1X分析缓冲液。 注意:10 mL 1X分析缓冲液足以用于一块板。 分装并在<-20℃下存储未使用的1X分析缓冲液。 避光并避免重复的冻融循环。
工作溶液配制
Fura-2 AM染料加载溶液:将20 µL Fura-2 AM储备溶液添加到10 mL 1X分析缓冲液中,并充分混合。 注意:该工作溶液在室温下至少可稳定2小时。
实验步骤
1.将100 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的Fura-2 AM染料加载溶液添加到细胞板中。 注意:如果您的化合物干扰血清,则需要用HHBS缓冲液代替生长培养基。
2.将染料加载板在细胞培养箱中孵育1小时,然后在室温下再孵育20分钟。 注意:如果测定需要37℃,请立即进行实验,而无需进一步室温孵育。
3.用HHBS或所需的缓冲液准备复合板。
4.通过监测Ex / Em = 340/510 nm和380/510 nm处的荧光增加来进行钙通量测定。 注意:在实验前进行信号测试非常重要。 不同的仪器具有各自的强度范围。 注意:对于在FDSS上进行的测定,请在仪器上对Fura-2钙测定使用标准滤波器。
图示
图1.用Screen Quest Fura-2 免洗钙含量测定试剂盒测量的CHO-K1细胞中的ATP剂量反应。 将CHO-K1细胞以40,000个细胞/ 100 µL /孔在Costar黑色96孔板中过夜接种。 将细胞与100 µL Screen Quest Fura-2 免洗钙含量测定试剂盒在室温下孵育1小时。 通过FlexStation(分子设备)添加ATP(50 µL /孔)以达到最终指示的浓度。
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参考文献
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