Luna® Cell Ready 裂解模块 货 号 #E3032S-NEB酶试剂 New England Biolabs

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Luna® Cell Ready 裂解模块                              收藏

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#E3032S
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特性

 ·仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除
 ·一次反应高效可裂解 10 至 10 万个细胞,适用于众多细胞系
 ·与其它 RNA 提取方法相比减少了样品损失,尤其对于低细胞起始量。
 ·兼容高通量应用,可在室温下进行细胞裂解
 ·与 Luna 通用一步法 RT-qPCR 试剂盒搭配使用时性能最佳:NEB#E3005(染料法)或 NEB#E3006(探针法) 
 ·提供完整的细胞裂解和一步法 RT-qPCR 试剂盒方案:NEB #E3030(染料法)或 NEB #E3031(探针法)

概述

   细胞培养常用于替代活体生物来分析基因表达或对治疗的反应。传统上使用柱提法或化学试剂法从处理过的细胞中提取和纯化 RNA.Luna Cell Ready 裂解模块无需进行传统的 RNA 提取步骤即可评估RNA表达水平,是一种快速、方便且灵敏的替代方案。该模块可同时进行细胞裂解、RNA 释放、基因组 DNA 去除,获得的细胞裂解物可直接使用Luna通用一步法 RT-qPCR 试剂盒进行 RT-qPCR 分析。与其它 Luna 产品一样,裂解缓冲液包含惰性蓝色示踪染料,使整个加样流程可视化。

下表列出的细胞系可使用 Luna Cell Ready 裂解模块裂解。这些细胞进行 5 log 梯度稀释(100000-10 细胞/50 µl 裂解反应),并取 1 ul 裂解产物进行 20 µl 体系的一步法 RT-qPCR 反应。每个细胞系的线性结果区域显示在最后一列。此外,经测试一些昆虫细胞系也能用上述裂解液裂解。

 

表一:经验证过的细胞系

细胞系

特性

菌种

50 ml 裂解体系中的细胞数量

A549

Adherent

H. sapiens, Lung, carcinoma

10 – 100,000

HEK293

Adherent

H. sapiens, Kidney

10 – 100,000

HeLa

Adherent

H. sapiens, Cervix, adenocarcinoma

10 – 100,000

HepG2

Adherent

H. sapiens, Liver, carcinoma

10 – 100,000

NCI-H460

Adherent

H. sapiens, Lung, carcinoma

10 – 100,000

SK-N-SH

Adherent

H. sapiens, Brain, Neuroblastoma

10 – 100,000

U2Os

Adherent

H. sapiens, Bone, osteosarcoma

10 – 10,000

Jurkat

Suspension

H. sapiens, T lymphocyte, leukemia

10 – 100,000

K-562

Suspension

H. sapiens, Lymphoblast, leukemia

10 – 1,000

 

图一:Luna Cell Ready 一步法 RT-qPCR 实验流程

 

Luna® Cell Ready 裂解模块            货   号                  #E3032S

 

Luna Cell Ready 裂解模块整合了 DNase I 和 Luna Cell Ready 蛋白酶的功能,可简单高效的进行细胞裂解,仅需 15 分钟即可完成细胞裂解、RNA 释放和基因组 DNA 去除。2 µl 裂解产物(相当于 0.2–4000 个细胞中的 RNA)即可实现 20 µl 体系的 RT-qPCR 反应。

 

试剂盒组分

 

随该产品提供的试剂

 

储存(°C

浓度

Luna Cell Ready Lysis Buffer

-20

2 X

Luna Cell Ready RNA Protection Reagent

-20

25 X

Luna Cell Ready Protease

-20

25 X

Luna Cell Ready Stop Solution

-20

10 X

DNase I RNase-free

-20

10 X

 实验需要但不提供的试剂耗材

  •    磷酸盐缓冲液(PBS
  •    目标特异性引物
  •    细胞
  •    Eppendorf
  •    PCR 联管
  •    PCR
  •    移液器和枪头(为减少交叉污染,应使用带滤芯的枪头)

    储存温度

 -20℃

Luna® 通用 qPCR 预混液 货 号 #M3003E-NEB酶试剂 New England Biolabs

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Luna® 通用 qPCR 预混液                              收藏

Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E

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#M3003E
2500次反应
10,659.00

#M3003L
500次反应
2,629.00

#M3003S
200次反应
1,169.00

#M3003V
100次反应
619.00

#M3003X
1000次反应
4,809.00

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相关产品:

南极热敏 UDG

特性

· 一种应用对应一种产品,简化选择
· 方便的预混液形式及易操作的实验步骤
· 肉眼可见的示踪染料避免加样失误
· Luna 系列产品经过严格的优化及检测以确保特异性、灵敏度、精确性及可重复性
· 独特校正染料,与多种 qPCR 设备兼容

概述

快速、灵敏、精确的实时荧光染料定量检测 DNA cDNA

使用实时荧光染料定量 PCR 时,最常用的荧光染料是 SYBR® Green I,后者与双链 DNA 结合,检测每个 PCR 循环中的 DNA 扩增情况。Cq 值是循环数量值,即检测到的荧光信号超过背景本底信号域值所经历的循环数,该 Cq 值可用于评估两个或两个以上的样本之间的相对丰度,也可以与已知浓度系列稀释的标准曲线进行对比,读取样本绝对值。

 

NEB Luna Universal qPCR Master Mix 是经过优化的 2X 预混液,可以用于实时定量 PCR检测和目标 DNA 的定量,适用于具有 SYBR®/FAM 通道的大部分 qPCR 设备。预混液含有热启动 Taq DNA 聚合酶及独特校正染料,与一系列 qPCR 设备兼容;预混液中使用了 dUTP,以防止产物残留污染;预混液中还加有非荧光染料,便于建立反应时进行肉眼观察,该染料的光谱与 qPCR 荧光染料不重叠,因此不会影响到实时检测数值。

 

预混液为 2X,包含除了模板和引物以外,用于 PCR 扩增和定量检测的所有组分。可以使用商业化的 qPCR 分析引物,用 Luna qPCR 产品进行基因组 DNA 或者 cDNA 的定量分析。 

 

图表一:NEB Luna Universal qPCR Master Mix qPCR 带来更高灵敏度及可重复性

   Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E

 使用 Luna Universal qPCR Master Mix 检测目标中 GAPDH 基因的表达情况,模板为 6个分别 10 倍稀释的 Jurkat cDNA (20 ng – 0.2 pg),每个浓度的样品做8个复孔。cDNA 是使用 NEB Protoscript® II First Strand cDNA Synthesis Kit (NEB #E6560) Jurkat 的总 RNA 反转录得来。

  

图表二:NEB Luna Universal qPCR Master Mix 为不同来源的 DNA 都能提供更高灵敏度和精确度的检测和定量

Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E

 Luna Universal qPCR Master Mix 可以检测不同来源的基因组 DNA。使用 ABI 7500 快速荧光定量仪器,50 ng – 0.5 pg 的基因组 DNA 对目标进行实时定量检测。基因组 DNA使用传统的柱纯化方法纯化。无论从小鼠肾脏的基因组检测 ACTB 基因、烟草基因组 DNA 检测 psbB 基因、还是从酵母基因组 DNA 中检测 rdn18SLuna 产品都有非常优秀的表现。

 

图表三通过与市场上基于染料的 qPCR 试剂对比,NEB Luna 产品体现出了更优的稳定性和特异性

 Luna® 通用 qPCR 预混液                 货   号                  #M3003E

使用 NEB 公司和其它供应商的试剂,分别对来自于 Jurkat 基因组 DNAJurkat cDNA不同丰度、长度和 GC 含量的 16-18 个目的基因进行检测(使用 Bio-Rad 机器检测 10 个基因组模板和 8 cDNA 模板,使用 ABI 的机器检测9个基因组模板和7 cDNA 模板)。每份检测结果由两个实验者根据厂商要求分别得到。使用反应效率、最低检测值以及无模板扩增来衡量结果(ΔCq = average Cq of lowest input – average Cq of non-template control)。此外,一致性、可重复性以及曲线的整体质量评估也作为实验的参考(标准分数)上面的点状图展示了符合可接受的性能标准的百分比(绿框圈起来的点的标准分>3)。不同厂商的结果如上图所示,从左到右分别是:NEBBio-Rad, SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix Roche, FastStart™ SYBR Green Master QIAGEN, QuantiTect® SYBR Green PCR Kit ABI, PowerUP™ SYBR Green Master Mix Promega®, GoTaq® qPCR Master MixNEB Luna Universal qPCR Master Mix 表现优于所有其它供应商试剂的结果。

注释

 1.  引物设计

使用相关软件(如 Primer 3)设计 qPCR 引物时,在减少非特异性扩增和引物二聚体的情况下提高扩增成功率。引物的 GC 含量为 40–60% 可以保证最大的扩增效率。在可能的情况下,尽可能多的输入目标周围区域序列,以便引物序列设计更加完善。使用检索功能,检索相关数据库以避免非特异性扩增。如果模板是 cDNA ,在设计引物的时候可以跨内含子区域来避免基因组的非特异性扩增。相反,如果引物设计在内含子区域则可以保证基因组区域的特异性扩增。

2.  引物浓度

对于大多数模板来说,引物的终浓度 250 nM 就可以达到要求。如果需要的话,引物的浓度可以在 100–500 nM 之间优化。

3.  扩增子长度

为了确保 qPCR 结果的成功和一致性,PCR 效率的最大化非常重要。其中一方面就是设计短的 PCR 产物(70-200 bp)。如果反应产物超出范围,可能需要对实验进行优化(比如增加延伸时间等)

4.  模板准备及相关浓度

Luna qPCR 试剂与通过典型的核酸纯化方法纯化的 DNA 样本都兼容。制备好的 DNA 可以长期稳定储存在包含 EDTA 的缓冲液中(如 1X TE),实验时使用 TE buffer 或者水进行稀释。

一般来说,标准品和未知样品的浓度范围应该在 1 个拷贝到 106 个拷贝之间。如果是大型基因组样本(如人类或老鼠的 gDNA)一般浓度为 50 ng-1 pg。如果是小型基因组样本,可以参考使用1 个拷贝到 106 个拷贝的浓度。对于单一样本的稀释,样本中需要包含多个拷贝和空白对照。对于 cDNA 样本,可以使用 1 μg0.1 pg RNA 的反转录产物。cDNA 样本不需要纯化,但是在使用之前需要至少稀释 10

5.  ROX 校正染料

有些实时定量设备建议使用校正染料(通常是 ROX)来校正由于气泡、微小的体积差别、管与管之间的差异及反应过程中尘埃或者微粒的自发荧光造成的反应差距。Luna Universal qPCR Master Mix 包含了通用型的校正染料,可以兼容不需要使用校正染料以及需要使用低浓度或者高浓度校正染料(ROX)的一系列的荧光定量检测仪器。因此,在使用这些仪器进行 qPCR 实验时,不需要额外的组分。

6.  预防污染

qPCR 是一种非常灵敏的检测方法,前个 qPCR 产物污染下一个样本会带来一系列的问题,如假阳性及灵敏度的下降。防止污染的最好办法就是严格按照程序操作,避免扩增后的开盖。为了进一步满足预防交叉污染的要求,Luna Universal qPCR Master Mix 中包含了 dUTP/dTTP,从而可以在扩增过程中将 U 掺入到 DNA 产物中。qPCR 前使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶(UDG)进行预先处理,就可以水解含有尿嘧啶的产物,以防止污染后续试验。使用能够完全失活的 UDG 是至关重要的,否则 UDG 会破坏新合成的 qPCR 产物。

为了避免产物携带污染,在反应体系中加入终浓度为 0.025 units/μl 的南极热敏 UDGNEB #M0372)。欲将污染的可能性降到最低,最好在室温下建立反应或者在变性步骤前加上

25℃ 温育 10 分钟

7.  反应条件设定

由于聚合酶的热启动性,在实验前不需要预热机器,也不需要在冰上加样。

如果使用96 孔板,建议使用 20 μl 反应体积。

如果使用 384 孔板,建议使用 10 μl 反应体积。在设定仪器的循环条件时,保证在延伸结束时包含一次读板并在循环结束后生成溶解曲线以分析产物的特异性。

大部分应用分析反应 40 个循环就可以,低起始量的样本可以反应 45 个循环。

Luna® 通用探针法 qPCR 预混液 货 号 #M3004E-NEB酶试剂 New England Biolabs

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Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                              收藏

Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E

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#M3004E
2500次反应
9,169.00

#M3004L
500次反应
2,259.00

#M3004S
200次反应
1,019.00

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100次反应
539.00

#M3004X
1000次反应
4,129.00

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相关产品

南极热敏 UDG

特性

·一种应用对应一种产品,简化选择
·方便的预混液形式及易操作的实验步骤
·肉眼可见的示踪染料避免加样失误
·Luna 系列产品经过严格的优化及检测以确保特异性、灵敏度、精确性及可重复性
·独特校正染料,与多种 qPCR 设备兼容

概述

  NEB Luna 通用 qPCR 预混液是经过优化的2X 预混液,用于实时定量 PCR 检测和目标 DNA 的定量,适用于具有 SYBR®/FAM 通道的大部分 qPCR仪器。

NEB Luna 通用探针法 qPCR 预混液是经过优化的2X 预混液,通过使用水解探针来进行实时定量PCR 检测和目标 DNA 的定量。
Luna 预混液中含有热启动 Taq DNA 聚合酶及独特校正染料,可以兼容多种仪器平台,包含需要ROX 染料校正的仪器。这意味着实验操作过程中不需要额外添加染料。预混液中包含 dUTP,qPCR前使用 NEB 的南极热敏 UDG 进行预处理以防止产物残留污染。预混液中还加有肉眼可见的蓝色染料,在向透明多孔 PCR 板中加样时起指示作用。快速、灵敏、精确的 Luna qPCR 产品必将成为您实时定量实验的首选。

luna产品选择表

Luna® 通用探针法 qPCR 预混液                 货   号                  #M3004E 

Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG) 货 号 #M3019E-NEB酶试剂 New England Biolabs

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Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)                              收藏

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#M3019E
2000 rxns
26,279.00

#M3019L
500 rxns
8,379.00

#M3019S
200 rxns
3,719.00

#M3019X
1000 rxns
14,889.00

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特性

 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 可精准检测目标 RNA,多重扩增检测性能优异,一次可检测多达 5 个靶标。

 •  单管预混液剂型使反应体系的建立更便捷

   4X 浓度的预混液可增加样品加入量,提高 RT-qPCR 灵敏度

   一次可检测多达 5 个靶标,增加检测通量

   Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用,提高反应特异性及稳定性并可室温建立体系

 •  预混液中包含 UDG dUTP防止模板残留污染 

 •  无干扰的可见示踪染料避免加样错误 

 •  点击 COVID-19 research 了解 NEB 如何将多种 RT-qPCR 病毒检测方法用于新冠研究

产品说明

  Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA,然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增,完成靶标的实时荧光定量 PCR(qPCR),整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性,将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光,并实时监测荧光值的增加,以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置,可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。


该预混液基于探针法化学原理,采用一步法 RT-qPCR 流程,因此可与 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒(NEB #E3006)进行对比
 
 1:用于一步法 RT-qPCR 实验的新产品
 Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E
 
Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 预混液,含 UDG 为 4X 浓度,因此在靶标 RNA 量极低的应用中(例如:病原体检测),可提高样品加入量。通过对 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测,显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中,包括:Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用,可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增,从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性,最佳反应温度为 55°C。此外,预混液还添加了独特矫对染料,可与多种 qPCR 仪器兼容,包括需要高 ROX 或低 ROX 参比信号的仪器。

图 2:使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对不同 RNA 病毒进行检测显示性能卓越
 
 Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对 SARS-CoV-2N1)和流感病毒 H1N1HA)进行  RT-qPCR。反应体系为 20 ul,对 5-log 浓度梯度样品进行扩增性能评估,使用两台荧光定量仪器进行平行测试。(A10–100,000 拷贝合成 SARS-CoV-2 RNA 对照 2Twist BiosciencesSKU102024)溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中(BioChain,#R1255815-50)。(B12.4–124,000 拷贝甲型流感病毒(H1N1RNAATCC®VR-95DQ)溶于 10 ng Jurkat 总 RNA 中。结果显示两个病毒靶标扩增的灵敏度和线性度都很理想。
 
图 3:使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 进行多重检测(个靶标)
 
Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E

 
使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 对 5-log 浓度梯度的 Jurkat 总 RNA100 ng-10 pg)进行多重 RT-qPCR,实验仪器为 Bio-Rad CFX96 荧光定量仪。结果显示了 个人源靶基因的扩增标准曲线和扩增效率。反应体系(20 μl)中引物和探针浓度均为 200 nM,反应设置为产品推荐的循环条件。在该多重反应中,个靶标均检测到良好的线性度、扩增效率和 R2 值。
 
 4Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 性能优于其它品牌
Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E

两位实验人员按照操作说明书,在几天的时间内,使用 Applied Biosystems™ QuantStudio™ 6 实时 PCR 系统,用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标(通过不同颜色显示)进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估:扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值(ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq)。此外,基于前面的度量值(质量得分)还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示:参与测试的两种试剂均表现不错,但 NEB 测试结果落在绿框里的数量更多,因此 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 性能优于 TaqPath 1-Step RT-qPCR预混液。

RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物,因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过50°C时会完全失活,因此对 qPCR 性能没有影响。

 
图 5RT-qPCR 避免模板残留污染的评估
 
Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E
为了评估不同试剂盒对去除模板残留物的能力,首先使用 Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 试剂盒制备含 U RT-qPCR 产物。然后使用三种不同的 RT-qPCR 预混液(均包含 UDG),将~105 拷贝的含 U 产物作为模板进行 qPCR。按照各品牌的操作说明,在第二个反应开始时进行 25°C 孵育使 UDG 降解含 dU 样品,以降低其产生(假)阳性信号的能力。ΔCq 是进行残留处理及未处理的循环数的差值。ΔCq 值越大说明去除残留产物的效率越高。使用 Luna 预混液去除污染后,一个样品中含 U 产物完全消化,另一个样品 ΔCq 较大。注意:在真实污染案例中,污染的 DNA 量很难评估/预测。

该预混液包含无荧光的可见蓝色示踪染料,有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠,也不会干扰实时检测。

Luna 通用探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG 包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误

Luna® 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液(含 UDG)            货   号                  #M3019E

 
 
 

 

Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX) 货 号 #M3029E-NEB酶试剂 New England Biolabs

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Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)                              收藏

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#M3029E
2000 rxns
26,279.00

#M3029L
500 rxns
8,379.00

#M3029S
200 rxns
3,719.00

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特性

 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)可精准检测目标 RNA,多重扩增检测性能优异,一次可检测多达 5 个靶标。

        特性
适用于不需要 ROX 参比染料的仪器
4X 浓度的预混液可增加样品加入量,提高 RT-qPCR 灵敏度
一次可检测多达 5 个靶标,增加检测通量
Luna 温启动反转录酶与 Taq 热启动 DNA 聚合酶联合使用,提高反应特异性及稳定性,并可室温建立体系
预混液中包含热敏 UDG 和 dUTP,防止模板残留污染
无干扰的可见示踪染料避免加样错误
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概述

 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)用于探针法实时荧光定量检测靶标 RNA。首先反转录酶将 RNA 转化为 cDNA,然后 DNA 聚合酶对 cDNA 进行扩增,完成靶标的实时荧光定量 PCR(qPCR),整个过程在单管内一次性完成。基于探针法的 qPCR / RT-qPCR 原理是利用聚合酶的 5´ → 3´ 外切酶活性,将淬灭的目标特异性探针切断发出荧光,并实时监测荧光值的增加,以测量每个循环中的 DNA 扩增。在荧光信号显著超过背景荧光的位置,可以确定 Cq 值。Cq 值可用于评估两个或多个样品的靶基因相对丰度。

 
Luna 探针一步法 RT-qPCR 预混液,含 UDG(无 ROX)为 4X 浓度,因此在靶标 RNA 量极低的应用中(例如:病原体检测),可提高样品加入量。通过对 5 个靶标进行不同浓度的线性、灵敏度检测,显示该产品在多重检测中性能更优。该预混液将一步法 RT-qPCR 所需组分整合到单个试管中,包括:Luna 温启动反转录酶、Taq 热启动 DNA 聚合酶、dNTP 和小鼠 RNase 抑制剂。Taq 热启动 DNA 聚合酶与新型温启动反转录酶联合使用,可通过基于适配体的可逆抑制来双重控制酶的活性。这种温控活化机制可避免热循环前的非特异扩增,从而让室温建立体系更安全。经改造的 Luna 温启动反转录酶具有更高的热稳定性,最佳反应温度为 55°C。该剂型不含参比染料,适用于不需要 ROX 参比染料的仪器(如需 ROX 矫正,可添加 ROX)。
 
RT-qPCR 的高灵敏度使得避免 DNA 污染尤为重要。由于先前扩增产物可作为后续反应的底物,因此反应体系加入 dUTP 和热敏 UDG 可防止模板残留污染。热敏 UDG 超过 50°C时会完全失活,因此对 qPCR 性能没有影响。
 
图 1:使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)检测病毒 RNA
 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)对 SARS-CoV-2(N1 基因)、Zika(POLY 基因)、Dengue(E 基因)、Chikungunya(E2 糖蛋白基因)进行 RT-qPCR 检测。配制 20 ul 反应体系,对 5-log 浓度梯度样品(100,000–10 拷贝/反应)进行扩增性能评估,实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。扩增模板为:新冠状病毒(SARS-CoV-2)合成 RNA Control 2(Twist Biosciences,SKU:102024)、寨卡病毒(ZIKV)合成 RNA(ATCC® VR-3252SD™)、2 型登革热病毒(Dengue)合成 RNA(ATCC VR-3229SD™),基孔肯雅病毒(Chikungunya)合成 RNA(ATCC VR-3246SD™),上述模板分别稀释于 10 ng Jurkat 总 RNA(BioChain,#R1255815-50)中。结果显示:所有病毒靶基因扩增的灵敏度和线性度都非常理想。
 
图 2:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型多重扩增性能一致
 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
 
使用 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型(NEB# M3019 和 NEB # M3029)对 5 log 浓度范围(100 ng至10 pg)的 Jurkat 总 RNA 进行多重 RT-qPCR,实验仪器为 Bio-Rad® CFX96 实时荧光定量仪。分别使用两种 Luna 试剂对 5 个人源靶基因制作扩增标准曲线。配制 20 μl 反应体系,其中引物和探针浓度均为 200 nM,使用产品推荐的循环条件。如 B 图所示,两种 Luna 试剂的 ACTIN(使用 Texas Red 标记探针)标准曲线重叠,这说明在没有 ROX 参比染料的情况下,扩增性能良好。如 C 图所示:针对 5 个靶基因的多重线性检测,均展现出良好的扩增效率和 R2 值。
 
图 3:探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG,含或不含 ROX 剂型均可得到高质量结果
 
 Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E
两位实验人员分别按照操作说明书,使用 Bio-Rad CFX96 实时荧光定量仪器,用两种荧光定量试剂盒分别对 8 个不同丰度、长度和 GC 含量的靶标(通过不同颜色显示)进行一步法 RT-qPCR 测试。反应结果就以下方面进行评估:扩增效率、低样品量检测能力及无模板扩增值(ΔCq=无模板对照的平均 Cq-最低起始量的平均 Cq)。此外,基于前面的度量值(质量得分)还评估了扩增结果的一致性、可重复性和总体曲线质量。结果显示:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)(NEB #M3029)和 Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(NEB #M3019)落在绿框里的结果数量相同,即两者检测性能一致。
 
该预混液包含无荧光的可见蓝色可见示踪染料,有助于透明管加样。该示踪染料与 qPCR 常用荧光基团的光谱没有重叠,也不会干扰实时检测。
 
图 4:Luna 探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)包含无干扰的可见蓝色示踪染料可避免加样错误

 
Luna探针一步法 RT-qPCR 4X 预混液,含 UDG(无 ROX)            货   号                  #M3029E