样品分析方案
储备溶液配制
1.蛋白质储备液（溶液A）
将100 µL反应缓冲液（例如1 M碳酸钠溶液或pH值为9.0的1 M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（例如抗体，如果可能，蛋白浓度> 2 mg / mL）混合，得到1 mL蛋白质标记储备液。
注意：蛋白质溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。如果蛋白质溶液的pH值低于8.0，请使用1 M碳酸氢钠溶液或1 M pH 9.0磷酸盐缓冲液将pH值调整为8.0-9.0。
注意：蛋白质应溶于pH 7.2-7.4的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如果将蛋白质溶解在Tris或甘氨酸缓冲液中，则必须使用pH 7.2-7.4的1X PBS进行透析，以去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如硫酸铵和乙酸铵）。
注意：如果蛋白质浓度低于2 mg / mL，结合效率会大大降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为2-10 mg / mL。
2.染料原液（溶液B）
将无水DMSO加入iFluor™460 SE小瓶中，制成10-20 mM储备液。通过轻柔移液或涡旋混合均匀。
注意：开始缀合之前，请准备染料储备溶液（溶液B）立即使用。染料储备溶液的长时间储存可能会降低染料活性，避免冻融循环。
注意：收到后，iFluor™染料应储存在<-15°C的环境中，并远离光线和湿气。
注意：重新配制的iFluor™染料SE的DMSO储备溶液可以在<-15°C下保存长达4周。
注意：所需的蛋白质缀合物应在载体蛋白质（例如0.1％牛血清白蛋白）存在的情况下以> 0.5 mg / mL的浓度保存。当在2 mM叠氮化钠存在下存储时，缀合物溶液可以在4°C下存储两个月而无明显变化。为了更长的存储时间，可以将蛋白缀合物冻干或分成单份使用，并保存在≤-60°C下，并避光。
操作步骤
该标记方案是针对山羊抗小鼠IgG与iFluor™460 SE的缀合物而开发的，供参考。您的实际情况可能需要进一步优化您的特定蛋白质。
确定最佳的染料/蛋白质比率（可选）
每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比率，这也取决于染料的性质。蛋白质的过度标记可能会不利地影响其结合亲和力，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。我们建议您使用一系列不同量的标记染料溶液，通过实验确定最佳的染料/蛋白质比率。通常，大多数染料-蛋白质缀合物推荐使用4-6种染料/蛋白质。
- 以溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的10：1摩尔比为起点：将5 µL染料储备溶液（溶液B，假定染料储备溶液为10 mM）添加到蛋白质瓶中。溶液（95 µL溶液A）有效摇动。假设蛋白质浓度为10 mg / mL，蛋白质的分子量为〜200KD，则蛋白质的浓度约为0.05 mM。
注意：蛋白质溶液中DMSO的浓度应小于10％。
- 进行缀合反应。
- 重复步骤2，溶液B /溶液A的摩尔比为5：1；15：1和20：1。
- 使用预制的旋转柱纯化所需的缀合物。
- 计算上述4种缀合物的染料/蛋白质比率（DOS）。
- 对以上4种缀合物进行检测，以确定最佳的染料/蛋白质比率，以扩大标记反应的范围。
进行缀合反应
- 在有效摇动下，将适量的染料储备溶液（溶液B）添加到蛋白质溶液（溶液A）的小瓶中。
注意：溶液B /溶液的最佳摩尔比由上述步骤确定。如果跳过该步骤（本节：确定最佳的染料/蛋白质比），我们建议使用溶液B（染料）/溶液A（蛋白质）的摩尔比为10：1。
- 在室温下继续旋转或摇动反应混合物30-60分钟。
纯化
以下方案是使用Sephadex G-25色谱柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。
- 准备Sephadex G-25色谱柱。
- 将反应混合物（步骤的最后一步：进行缀合反应后的混合物）加载到Sephadex G-25色谱柱的顶部。
- 样品刚好在顶部表面下方流动时，立即添加PBS（pH 7.2-7.4）。
- 向所需样品中添加更多PBS（pH 7.2-7.4），以完成柱纯化。
注意：为了立即使用，染料-蛋白质偶联物需要用染色缓冲液稀释，并分装多次使用。
注意：为了长期保存，染料-蛋白质结合物溶液需要浓缩或冷冻干燥（见下文）。
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